Trọng Khôi đã rất yêu thích nghề diễn viên từ nhỏ. Suốt thời niên thiếu, Trọng Khôi không bỏ lỡ các cơ hội tham gia sinh hoạt kịch nghiệp dư trong các buổi liên hoan tổng kết ở trường từ bậc tiểu học đến trung học phổ thông.

Lên 7 tuổi, Trọng Khôi đã được diễn ở Nhà hát Lớn Hà Nội với vai diễn Lê Lai trong vở kịch "Lê Lai liều mình cứu chúa" theo sách học lịch sử của nhà trường do thầy giáo hướng dẫn.

Với một niềm đam mê nghề diễn từ nhỏ, ông tham gia Đội kịch Thanh niên của Thành đoàn Thanh niên Lao động Hà Nội 1958–1960. Sau khi tốt nghiệp cấp 3 trường Lý Thường Kiệt Hà Nội (1959–1960), ông thi vào trường trung cấp Nghệ thuật Sân khấu Việt Nam năm 1960. Sau này trường chuyển đổi thành Đại học Sân khấu. Ông đã tốt nghiệp khóa 1 của trường Đại học Sân khấu tháng 6 năm 1964. Kể từ đó, ông tham gia công tác tại Đoàn Kịch Trung ương tiền thân của Nhà hát Kịch Việt Nam.

Năm 1970, ông là Đội trưởng Đội Kịch nói Nhà hát Kịch Việt Nam.

Giai đoạn 1985–1989 ông đảm nhận vị trí Phó Giám đốc Nhà hát Kịch Việt Nam. Sau đó, 1989–2000 ông chịu trách nhiệm của Giám đốc Nhà hát.

Trong quá trình đó, những năm 1985, 1995, 1999, ông là Ủy viên Ban Chấp hành Hội Nghệ sĩ Sân khấu Việt Nam nhiệm kỳ IV.

Từ 1999–2009, ông đảm nhận Chủ tịch Hội Nghệ sĩ Sân khấu Việt Nam nhiệm kỳ V và VI.

Từ 2010 đến này ông giữ vị trí Ủy viên Ban Chấp hành, Thường vụ Hội Nghệ sĩ Sân khấu Việt Nam và Trường Ban Đối Ngoại. Trong thời gian đó, từ năm 2004 đến 2009, ông giữ cương vị Chủ tịch Hiệp Hội Sân khấu Quốc tế Việt Nam

Trong cuộc đời cống hiến của mình, ông vẫn luôn mơ ước và đã đề xuất ý tưởng Việt Nam cần "có một trung tâm văn hóa quốc gia" để thỏa mãn về hội nhập văn hóa quốc tế cũng như đáp ứng nhu cầu văn hóa của người dân Việt Nam.

Ông từ trần vào hồi 5h45’ ngày 14/3 tại Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội, sau một thời gian chống chọi với căn bệnh hiểm nghèo, hưởng thọ 69 tuổi.[2]